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熒光定量中定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別?

  • 發(fā)布日期:2019-01-17      瀏覽次數(shù):2077
    •   熒光定量中定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別?
        熒光定量通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。
        定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目,即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例,而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。
        舉例來(lái)說(shuō),如果研究項(xiàng)目中包括處理過(guò)的和未經(jīng)處理的對(duì)照樣本,通常可以將未經(jīng)處理的樣本為基準(zhǔn),規(guī)定其目的基因濃度為100%,將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對(duì)照樣品的定量結(jié)果,就可以計(jì)算各個(gè)處理樣本的基因含量相對(duì)于未處理樣品的百分比。
        定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
        相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法:標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,可以使用標(biāo)準(zhǔn)品,也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品,而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品,典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
        CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系,來(lái)計(jì)算不同樣本之間的相對(duì)百分比,其計(jì)算公式是。
        定量的數(shù)據(jù)易于理解,但是標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測(cè)定其DNA含量比較困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購(gòu),可以解決這種困難。
        相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實(shí)驗(yàn)室里自己制備,但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。
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